ВЛИЯНИЕ НАНОЧАСТИЦ МАГНЕТИТА (МАГНИТОУПРАВЛЯЕМОГО СОРБЕНТА - МУС-Б) НА ПОКАЗАТЕЛИ АГРЕГАЦИИ ТРОМБОЦИТОВ

Белоусов А.Н. 

 

Актуальность. С помощью системы гемостаза кровь выполняет свою важнейшую функцию - поддержание жидкого состояния крови. Система гемостаза многокомпонентная.Способность крови свертываться является биологически активным механизмом, предохраняющим организм от кровопотери при различных повреждениях. В свертывании крови участвуют тромбоциты. Тромбоциты, кровяные пластинки, или пластинки Биццоцеро, представляют собой мельчайшие плазматические комочки, образующиеся в костном мозге при отщеплении участков цитоплазмы от мегакариоцитов. Функции тромбоцитов разнообразны. По отношению к сосудистой стенке они выполняют трофическую функцию - выделяют вещества, способствующие нормальному функционированию эндотелия. Сами по себе они способны к адгезии и агрегации, что обеспечивает сосудисто-тромбоцитарный гемостаз; тромбоциты благодаря высокой подвижности и образованию псевдоподий фагоцитируют инородные тела и вирусы, участвуют в иммунобиологических реакциях благодаря способности фагоцитировать иммунные комплексы и неорганические частички. Защитная функция связана с остановкой кровотечения. В системе свертывания крови различают сосудисто-тромбоцитарный (первичный) и коагуляционный (вторичный) механизмы гемостаза. Роль тромбоцитов в первичном гемостазе определяется их способностью прилипать к сосудистой стенке у места повреждения (адгезия), подвергаться биохимическим и структурным изменениям, высвобождать содержимое своих гранул (реакция освобождения) и склеиваться друг с другом (агрегация). Адгезия тромбоцитов происходит только к поврежденному эпителию при контакте с соединительной тканью, главным образом с коллагеном. Еще до взаимодействия с нею тромбоциты утрачивают свою форму и превращаются в звездчатые образования с многочисленными псевдоподиями, что позволяет им лучше приклеиваться к эндотелию и друг к другу [1]. Механизм адгезии связан с ς -потенциалом тромбоцитов: группы отрицательно заряженных сиаловых кислот на их мембране реагируют с положительно заряженными аминогуппами коллагена сосудистой стенки. Реакция освобождения является активным секреторным процессом, протекающим без повреждения мембраны и разрушения клеток. Освобождение может протекать в один или два этапа. 

Первый этап. Вначале происходит выделение содержимого плотных гранул тромбоцитов - АТФ, АДФ, адреналина, серотонина (сосудосуживаю-щие вещества); кальция, фактора 4 тромбоцитов, нейтрализующего гепарин, фактора 3 тромбоцитов - фосфолипида, участвующего в свертывании крови.

Второй этап. Если повреждающий стимул достаточно силен, процесс продолжается: высвобождаются фибриноген, ряд ферментов, катепсины.
Выделение АТФ и других факторов при реакции высвобождения способствует дальнейшей агрегации тромбоцитов. Препятствуют агрегации: повышение уровня цАМФ в тромбоцитах; простагландины Е и D; простациклин (активный вазодилататор) [2].
Нарушение функций тромбоцитов приводит к изменению гемостаза и развитию патологических состояний в системе кровообращения.К этиологическим факторам, вызывающим тромбоцитопатию, относят действие токсических веществ и лекарственных препаратов (алкоголь, ацетилсалициловая кислота), ионизирующая радиация, эндогенные метаболиты (при уремии, циррозе печени); дефицит цианокобаламина, гормональные нарушения (гипотиреоз). Наблюдаются и генетические дефекты структуры мембраны и биохимического состава тромбоцитов (дефицит тромбостенина, фактора 3, АТФ, АДФ, Г-6-ФДГ, мембранных рецепторов для факторов V, VIII, XI и др.) [3].
 
В настоящее время методы и способы коррекции параметров гемостаза остаются одними из актуальных в клинической медицине.
Так, например, в настоящее время возможность ингибирования адгезии и агрегации тромбоцитов, которая является важным в механизме развития сердечно-сосудистой патологии - краеугольная проблема современной кардиологии. Справедливости ради следует сказать, что современная медицина имеет в своем арсенале фармакологические препараты способные активно угнетать функции тромбоцитов, но чрезмерное угнетение может приводить к утрате их защитного действия [1].
Напротив, сравнительно небольшое ингибирование агрегации тромбоцитов приводит к значимому повышению выживаемости больных в основных группах риска сосудистых осложнений [2].
 
Появление в медицине нового направления - нанотехнологии позволяет не только искусственно синтезировать биологически адаптированные к живому организму наночастицы, но и направленно воздействовать на про-цессы клеточного обмена, влиять на функциональную активность клеток крови. Нанотехнология находится пока в самом начале своего развития, однако уже сейчас ясно, что крохотные наночастицы, размером в одну миллионную часть булавочной головки, открывают новые направления в различных областях медицины [4]. По определению ведущего учёного в данной области Р. Фреймана наномедицина это: «Слежение, исправление, конструирование и контроль над биологическими системами человека на молекулярном уровне, используя разработанные наноустройства и наноструктуры» [5].
 
В Украине первые препараты медицинской нанотехнологии синтезированы и запатентованы А.Н. Белоусовым в 1998 году. Это такие препараты как интракорпоральный нанобиокорректор "ИКНБ", магнитоуправляемый сорбент марки МУС-Б и «Микромаг-Б» [6-9]. Основу препаратов составляют коллоидные частицы магнетита (Fe3O4) размером от 6 до 12 нм. Наличие адсорбционного слоя обеспечивает коллоидным частицам магнетита высокую сорбционную активность. Суммарная площадь их сорбционной поверхности составляет от 800 до 1200 м2/г, напряженность магнитного поля, которое индуцируется каждой частицей - 300-400 кА/м, ζ - потенциал = -19 мВ.
 
Для наночастиц магнетита присущ, как сорбционный, так и косвенный эффект, который обусловлен действием постоянного магнитного поля, создаваемого коллоидными частицами магнетита [10].
 
Применение наночастиц магнетита позволит реально приблизиться к решению существующих проблем в коррекции систем гемостаза, в оптимальной степени ингибировать реакцию агрегации тромбоцитов.
В настоящее время в литературе отсутствуют сведения об изучении влияния наночастиц на агрегацию тромбоцитов, нет данных о разработке эффективного способа их применения.
 
Основная цель работы - в эксперименте экстракорпорально ингибировать реакцию агрегации тромбоцитов с помощью наночастиц магнитоуправляемого сорбента (МУС-Б).


Материалы и методы исследования.

Изучение влияния наночастиц магнитоуправляемого сорбента (МУС-Б) на показатели агрегации тромбоцитов проводили в ЦНИЛ ХГМУ.
Материал исследования: цитратная кровь практически здоровых людей из числа добровольцев (14 человек).
В асептических условиях из кубитальной вены бралась венозная кровь в количестве 16 мл. В последующем набранный объем крови равными частями (по 4 мл) распределялся в 4 пробирках. Условно 4 пробирки разделены по четырем опытам:

Опыт 1 - пробирка с контрольной венозной кровью;
Опыт 2 - венозная кровь + 2 мл физ. р-ра NaCl ;
Опыт 3 - венозная кровь + 2 мл 4,5% коллоидного р-ра МУС-Б;

Опыт 4 - венозная кровь + 2 мл 4,5% коллоидного р-ра МУС-Б.
 
В последующем МУС-Б выделялся из крови с помощью постоянного магнита напряженностью 20 мТл на протяжении 3 минут. Количество и концентрация вводимого коллоидного р-ра МУС-Б использованы согласно ранее разработанного метода А.Н. Белоусовым [10].

 Физико-химические свойства МУС-Б :
- суммарная площадь поверхности Sп = 800-1200 м2/г;
- намагниченность насыщения Is = 2,15 кА/м;
- объемная концентрация q = 0,00448;
- вязкость η = 1,0112 cSt;
- ζ - потенциал = - 19 мВ.

 Количественное определение активности агрегации тромбоцитов с использованием агрегометра А-1 проводили по методу Борну в модификации Захария и Кинаха [11-14].

Метод основан на фотометрическом определении изменений процента светопроницаемости (оптической плотности), которые происходят в обогащенной тромбоцитами плазме в результате образования агрегатов при агрегации тромбоцитов.
Расчеты показателей активности агрегации тромбоцитов проводились согласно формулам:

 1). Расчет скорости агрегации тромбоцитов (САТ) по формуле:
          Е1 - Е2
САТ = ----------- ,
              t
где: Е1 - оптическая плотность плазмы до агрегации в единицах оптической плотности;
Е2- оптическая плотность плазмы после агрегации в единицах оптической плотности;
t - время, за которое состоялось максимальное падение оптической плотности в минутах.

2). Расчет индекса агрегации тромбоцитов (ИАТ) по формуле:
           Е1 -Е2
ИАТ = ------------ х 100%,
               Е1
где: Е1- оптическая плотность плазмы до агрегации в единицах оптической плотности;
Е2- оптическая плотность плазмы после агрегации в единицах оптической плотности.

3). Расчет индекса дезагрегации тромбоцитов (ИДТ) по формуле:
            Е3 - Е2
ИДТ =   --------  х100%,
              Е3
где: Е3 - максимальная оптическая плотность плазмы через 10 минут после добавления АДФ;
Е2- минимальная оптическая плотность плазмы после агрегации в единицах оптической плотности.

Полученные результаты были статистически обработаны методом вариационной статистики сравнения средних значений по t-критерию Стъюдента.

Полученные резульаты и их обсуждение.

Для выявления основных механизмов действия наночастиц магнетита на показатели агрегации тромбоцитов исследованы различные варианты обработки крови МУС-Б. Наряду с контролем и вариантами обработки крови наночастицами МУС-Б, также изучалось влияние физиологического р-ра NaCl на исследуемые параметры агрегации тромбоцитов.Показатели агрегации тромбоцитов в зависимости от различных вариантов обработки крови растворами представлены в таблице 1.

Таблица 1.

Влияние различных вариантов обработки крови растворами на показатели агрегации тромбоцитов (n=14; M±m).

Примечания: p1 - в сравнении с первым опытом (контролем); p2 - в сравнении со 2-м опытом (кровь + физ. р-р); p3 - в сравнении с 3-м опытом (кровь + МУС-Б).
 
Данные таблицы №1 наглядно демонстрируют, что применение физ. р-ра, в сравнении с контролем, вызывает достоверное (р<0,001) увеличение скорости на 0,025 опт.пл./мин и индекса агрегации тромбоцитов - на 9,1 %. При этом, достоверного уменьшения индекса дезагрегации тромбоцитов не отмечено.
 
В третьем опыте, где в венозной крови находился МУС-Б, в сравнении с контролем, достоверно (р<0,001) отмечено резкое снижение скорости на 0,0108 опт.пл./мин и индекса агрегации тромбоцитов - на 12,4 %. Также дос-товерно (р<0,001) выявлено увеличение индекса дезагрегации тромбоцитов на 12%.
 
В четвертом опыте, где осуществлялась обработка венозной крови МУС-Б с последующим его выделением, в сравнении с контролем, выявлено достоверное (р<0,001) увеличение скорости на 0,017 опт.пл./мин и индекса агрегации тромбоцитов - на 7%. Достоверного увеличения дезагрегации тромбоцитов не выявлено. Однако в сравнении со 2-м опытом, где в кровь добавлялся физ. р-р, достоверно (р<0,01) выявлено увеличение индекса дезагрегации тромбоцитов на 5%.
Анализ полученных результатов между 3-м и 4-м опытом показал, что основная причина отличия полученных эффектов связана с разными вариантами применения наночастиц МУС-Б.
 
В третьем опыте наночастицы МУС-Б не извлекались из крови. Обладая выраженной сорбционной активностью (общая площадь сорбционной поверхности МУС-Б = 800-1200 м2/г) определенное количество наночастиц МУС-Б сорбировалось на поверхности белковых структур мембран тромбоцитов. Следует предположить, что индуцируемое постоянное магнитное поле (300-400 кА/м) коллоидными частицами МУС-Б на поверхности мембран тромбоцитов изменило не только биоэлектрический заряд [15], но и оказало влияние на биохимические процессы, активность ферментных систем. В результате чего активировались процессы дезагрегации, уменьшились скорость и индекс агрегации тромбоцитов, что и было получено в опыте.

Данные И.М. Мовшовича и М.А. Шило подтверждают вышесказанное. Магнитное поле замедляет СОЭ и улучшает микроциркуляцию, что связано с его дезагрегационным эффектом, снижением вязкости и гемостатического потенциала крови с улучшением ее реологических свойств [16]. Н.Ф. Леженина и В.Н. Родионов также отмечают, что использование магнитной гемотерапии в сочетании с гемосорбцией позволяет снизить дозу антикоагулянтов [17].

Рассуждая о механизме полученных эффектов, следует сказать, что магнитное поле может вызывать синхронизацию изначально слабых колебаний нескольких групп клеток (триггерная реакция), что подтверждается научными работами ряда авторов [16, 18, 19]. Такие синфазные колебания могут служить информационным сигналом для различных регуляторных систем организма, что приводит к различным макроскопическим эффектам в виде конформационной перестройки клеточных структур. Автоколебания, вероятно возникающие в мембранах клеток крови, когда колеблющийся участок мембраны начинает выполнять роль насоса, оказывают существенное влияние на ионный и молекулярный транспорт веществ через мембрану клетки. А магнитное поле вообще - на процессы перекисного окисления липидов и окислительно-восстановительные процессы, на элементы клеточных структур, молекулы белков-ферментов, обладающие дипольным моментом [20].
 
Дополняя перечень механизмов воздействия магнитных полей на биологические процессы следует отметить и процесс структурирования воды с изменением ориентации ядерных спинов водорода в ее молекуле, что, вероятно, также влияет на ход ферментативных процессов [21, 22].
 
Таким образом, в третьем опыте мы наблюдали эффект превалирования магнитных свойств наночастиц МУС-Б над сорбционными, что и было подтверждено в эксперименте.

Напротив, в четвертом опыте, где при помощи постоянного магнитного поля (напряженностью 20-25 мТ) МУС-Б извлекался из венозной крови, сорбционные свойства наночастиц преобладали над магнитными [10].

В этом случае механизм действия МУС-Б прежде всего был связан с эффектом сорбции поверхностных белков мембран клеток крови [23]. Адсорбция наночастицами МУС-Б с поверхности тромбоцитов плазменных белков, фибриногена, фибрина и других макромолекул приводит к увеличению отрицательного мембранного заряда, следствием чего является уменьшение их адгезии и агрегации. Достоверное уменьшение скорости агрегации тромбоцитов (р<0,05) и увеличение индекса дезагрегации тромбоцитов (р<0,01) в сравнении с опытом, где применялся физ. р-р - результат вышеуказанного эффекта.

Заключение.
 
Результаты проведенного исследования позволили выявить, что использование физиологического раствора NaCl в условиях выраженного нарушения микроциркуляции и реологии крови, с целью их улучшения, не только сомнительно, но и не безопасно. При этом коллоидно-суспензионное равновесие клеток крови (тромбоцитов) смещается в сторону достоверного (p<0,001) увеличения скорости и индекса агрегации.
 
Напротив, в результате применения наночастиц МУС-Б достоверно (p<0,05) выявлено увеличение коллоидно-суспензионной устойчивости клеток крови (тромбоцитов), что в условиях нарушения микроциркуляции и реологии крови является важным патогенетическим фактором для возникновения саногенетических эффектов.
 
В случае обеспечения сосудисто-тромбоцитарного гемостаза обработка крови наночастицами МУС-Б, может быть также предпочтительнее, чем введение физ. р-ра. Прежде всего, это связано с возможностью восстановления ζ-потенциала клеток крови (тромбоцитов) наночастицами магнетита. Это вызывает их адгезию, а выделение АТФ и других факторов при реакции высвобождения способствует дальнейшей агрегации тромбоцитов [24].
 

Выводы.

1. В эксперименте экстракорпорально ингибирована реакция агрегации тромбоцитов с помощью наночастиц магнитоуправляемого сорбента (МУС-Б).

2. Наличие в крови наночастиц МУС-Б, в сравнении с контролем, достоверно (р<0,001) снижает скорость на 0,0108 опт.пл./мин и индекс агрегации тромбоцитов - на 12,4 %. При этом также достоверно (р<0,001) увеличивается индекс дезагрегации тромбоцитов на 12%.

3. Обработка венозной крови МУС-Б с последующим его выделением, в сравнении с контролем, достоверно (р<0,001) увеличивает скорость на 0,017 опт.пл./мин и индекс агрегации тромбоцитов - на 7%. В сравнении с физ. р-ром методика применения наночастиц МУС-Б достоверно (р<0,01) увеличивает индекс дезагрегации тромбоцитов на 5%.

4. Применение физ. р-ра в сравнении с контролем вызывает достоверное (р<0,001) увеличение скорости на 0,025 опт.пл./мин и индекса агрегации тромбоцитов - на 9,1 %. При этом, достоверного уменьшения индекса дезагрегации тромбоцитов не отмечено.


Использованная литература:

1. Основы физиологии человека / Под ред. Б.И. Ткаченко - Санкт-Петербург: Международный фонд истории науки, 1994. - Т.1.- 566 с.

2. Зайко Н. Н., Быць Ю. В., Атаман А. В. и др. Патологическая физиология системы крови. В кн.: Патологическая физиология. - К.: "Логос", 1996. - С. 125-130.

3. Клиническая трансфузиология // А.Г.Румянцев, В.А. Агрененко, П.Г. Брюсов и др. - М.: ГЭОТАР «Медицина», 1997. - 235 с.

4. http://www.foresight.org/Nanomedicine/Respirocytes.html

5. http://www.kurzweilai.net

6. Лечебно-профилактический продукт "Micromage-B": Госпатент №30538А UA A 23L 1/304/ Белоусов А.Н. (Украина). - Заявл. 25.05.98. Опубл. 15.11.00. Бюл. № 6-11. - 3 с.

7. Сорбент для экстракорпоральной детоксикации биологических жидкостей: Госпатент №24322А UA A61N2/00/ А.Н. Белоусов (Украина). - Заявл. 19.06.97; Опубл. 17.07.98. Бюл. №7. - 4 с.

8. Cпособ получения магнитной жидкости для транспорта и удержания лекарств в организме: Госпатент №14817А UA A61N2/00/ А.Н. Белоусов (Украина). - Заявл. 21.06.96; Опубл. 18.02.97. Бюл. №2. - 3 с.

9. Способ экстракорпоральной детоксикации биологических жидкостей: Госпатент №24183А UA A61N2/00/ А.Н. Белоусов (Украина). - Заявл. 19.06.97; Опубл. 17.07.98. Бюл. №7. - 3 с.

10. Білоусов А.М. Екстракорпоральна гемокорекція із застосуванням магнітокерованого сорбенту в інтенсивній терапії синдрому інтоксикації у хворих з патологією органів гепатопанкреатодуоденальної зони: Автореф. дис... д-ра мед. наук: 14.01.30 / ДДМА - Дніпропетровськ, 2004. - 40 с.

11. Наказ МОЗ СССР №960 від 15.10.74 р. "Об унификации клинических и лабораторних методов исследования". Спрощений засіб визначення агрегації і дезагрегації тромбоцитів по Борну в модифікації Захарія, Кінаха.

12. Пособие по взучению адгезивно-агрегационной активности тромбоцитов./ Берковский А.Л., Васильев С.А., Жердева Л.В.и др. М., 2002, 28 с.

13. Северина И.С., Бусыгина О.Г., Пятакова Н.В. Активция растворимой гуанилатциклазы новьми донорами NО, как основа направленного поиска новых зффективных вазодилататоров и антиагрегантов. // Вестник РАМН - 2000. - Т 4. - С.25-30.

14. Чирков Ю.Ю., Белушкина Н.Н., Тыщук И.А., Северина И.С. Роль гуанилатциклазы в регуляции агрегации тромбоцитов человека / Вестник АМН СССР.-1991.- К 10.- С.51-55.

15. Белоусов А.Н. Влияние нового метода экстракорпоральной гемокоррекции с применением магнитоуправляемого сорбента на систему кровообращения у больных с синдромом интоксикации. // Медицина сегодня и завтра, ХГМУ, 2000. - №1. - С. 85-89.

16. Мовшович И.М., Шило М.А. К вопросу о действии МП на биологические системы. В кн.: Материалы 2-го Всесоюзного совещания по изучению влияния магнитных полей на биологические объекты. - М., 1969. - С. 155-158.

17. Леженина Н.Ф., Родионов В.Н. Метод клинической токсометрии в оценке эффективности лечения токсической энцефалопатии в соматогенной фазе острых отравлений. В кн.: Теоретические и клинические проблемы современной реаниматологии. / Материалы международного симпозиума. - М., 1999. - С. 88.

18. Классен В.И. О влиянии слабых магнитных полей на водные системы. В кн.: Реакция биологических систем на слабые магнитные поля. / Материалы Всесоюзного симпозиума. - М., 1971. - С. 14-16.

19. Ковальчук А.В. О некоторых механизмах действия ПМП на биологические объекты. В кн.: Реакция биологических систем на слабые магнитные поля. / Материалы Всесоюзного симпозиума. - М., 1971. - С. 29-33.

20. Лужников Е.А., Гольдфарб Ю.С. Физиогемотерапия острых отравлений. М.: Медпрактика. - М. - 2002. - 199 с.

21. Piccardi G. L'influence des phenomenes terretres, solaires et cosmiques sur les reactions phisico-chimiques et biologiques. - Bruxelles. - 1956. - 123 p.

22. Straub K.D., Carver P. Effects of electromagnetic fields on microsomal ATPase and mitochondrial oxidative phosphorylation. // Ann. N.Y. Acad. Sci. - 1975. - Vol.6. - P.247-254.

23. Белоусов А.Н. Влияние магнетита - препарата нанотехнологии на клеточный метаболизм // Вісник проблем біології і медицини, Полтава, 2003. - №7.- С. 36-37.

24. Белоусов А.Н., Белоусова Е.Ю. Первые шаги на пути к открытию механизмов клеточной регуляции препаратами нанотехнологии // Тр. X Международной конференции «Новые информационные технологии в медицине и экологии», Ялта-Гурзуф, 2002. - С.420-425.

 

 


© 2008 — 2019 «Лаборатория прикладных нанотехнологий»
Разработка и поддержание сайта - seozavr.com