ВЛИЯНИЕ ФИЗИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ НАНОЧАСТИЦ МАГНЕТИТА НА МИКРООРГАНИЗМЫ

Andrey Belousov*, Yulia Voyda**

*Laboratory of Applied Nanotechnology of Belousova, Engineering Invest IF GmbH

**Kharkov Medical Academy of Postgraduate Education

 

Резюме: Исследовано влияние основных физических факторов наночастиц магнетита (постоянного магнитного поля и сорбции) на микроорганизмы путем изучения реакций интенсивности свободно-радикального перекисного окисления липидов (СРПО) и бактериостатического действия. Достоверно установлено, что наночастицы магнетита в разных микроорганизмах вызывают неодинаковую по интенсивности реакцию СРПО. Выявлено, что у Candida albicans, E. coli и P. aeruginosa более значимым физическим фактором влияния на показатель конечной интенсивности свечения, было действие постоянного магнитного поля, которое индуцируется наночастицами. Напротив, у S. aureus, более значимым фактором на данном этапе, была сорбция. Установлено, что скорость расходования свободных радикалов липидной природы достоверно снижается у всех микроорганизмов после их обработки наночастицами магнетита. Микробиологические исследования показали, что после контакта E. coli, K. pneumoniae и S. aureus с наночастицами магнетита отмечается бактериостатический эффект. Визуально, это проявилось уменьшением количества выросших колоний на питательной среде в сравнении с контролем. Интересным фактом выявлено и то, что физиологический раствор NaCl, который предварительно был обработан наночастицами магнетита также достоверно оказывал выраженное бактериостатическое действие на исследованные группы микроорганизмов. Данный эффект объясняется механизмом изменения поляризационной структуры водной среды микроорганизмов наночастицами магнетита. Обнаружено, что варианты выраженности бактериостатического действия наночастиц магнетита коррелируют с показателями реакций интенсивности СРПО. Максимальный бактериостатический эффект у S. aureus сильнее всего выражен в 2 варианте применения наночастиц магнетита, где механизм сорбции был более значим, чем действие магнитного поля. Напротив, у Е. coli и K. pneumoniae максимальный бактериостатический эффект был выявлен в 3 варианте, где время экспозиции контакта наночастиц с микроорганизмами, а, следовательно, и действие постоянного магнитного поля было определяющим.

Ключевые слова: наночастицы магнетита, микроорганизмы, свободно-радикальное перекисное окисление липидов, поляризационная структура, бактериостатический.

Актуальность. Проблему устойчивости бактерий к антибиотикам врачи называют одной из самых серьезных угроз для человечества. Если эта проблема не будет решена, то через 20 лет, даже небольшая хирургическая операция, может привести к смерти от неизлечимой инфекции, главный государственный санитарный врач Дам Салли Дэвис предупреждает: "Это растущая проблема, и, если мы не получим это право, мы окажемся в системе здравоохранения не отличаются от начала 19 века". В Великобритании, хотя внутрибольничных инфекций от ошибок, таких как MRSA (Methicillin Resistant Staphylococcus Aureus) и C.difficile, были значительно сокращены по сравнению с уровнем 10 лет назад - падение на 80 процентов - их заменяют другими бактериями, такими как кишечная палочка и клебсиелла, которые в настоящее время есть наиболее частые агенты внутрибольничных инфекций. Около 5000 пациентов в год в Великобритании умирают от сепсиса, половина из них вызвана лекарственно-устойчивыми организмами. Устойчивость к противомикробным препаратам является миной-бомба не только для Великобритании, но и для всего мира. Многие специалисты считают, что в будущем антибиотики вообще станут бесполезными, и человечеству придется от них отказаться [1]. Уже сейчас количество новых антибиотиков катастрофически сократилось. Устойчивость к антибиотикам приводит к тому, что люди болеют в течение более длительного времени, и вероятность смертельного исхода повышается. Устойчивость также приводит к увеличению расходов на медицинскую помощь в результате более длительного пребывания в стационарах и предполагает необходимость более интенсивного лечения. Разработка новых антибактериальных средств на основе наночастиц – один из реальных путей решения данной проблемы. Первые научные публикации об изучении влияния наночастиц магнетита на микроорганизмы появились в 1998 году. Были представлены достоверные данные о бактериостатическом действии наночастиц магнетита по отношению к некоторым патогенным микроорганизмам. Также было установлено, что наночастицы магнетита существенно повышают чувствительность патогенных микроорганизмов к действию антибактериальных препаратов [2]. Кроме того, на примере изучения эритроцитов человека было показано, что наночастицы магнетита достоверно изменяют поляризационную структуру водного сектора микросреды клеток в результате чего, изменяется их проницаемость [3]. Таким образом, анализируя данные вышеперечисленных исследований можно с высокой степенью оптимизма говорить о перспективном развитии нового направления - создание антибактериальных средств на основе наночастиц магнетита, механизм действия которых, прежде всего, связан с изменением физических факторов существования клетки. Однако, на сегодняшний день остаются мало изученными механизмы физического влияния наночастиц магнетита на микроорганизмы, что и явилось основной целью данных исследований.   

Основная цель работы – исследовать влияние основных физических факторов наночастиц магнетита на микроорганизмы.

Для выполнения поставленной цели были поставлены следующие задачи:

- исследовать влияние наночастиц магнетита на интенсивность свободно радикального перекисного окисления (СРПО) в различных бактериальных средах;

- исследовать прямое бактериостатическое действие наночастиц магнетита на микроорганизмы;

- изучить бактериостатическое действие физиологического раствора NaCl, который предварительно обработан наночастицами магнетита;

- установить причинно-следственную связь между результатами исследований и основными физическими факторами наночастиц магнетита.

 

Материалы и методы.

Материалы: коллоидный раствор магнитоуправляемого сор­бента (МУС-Б). Основа МУС-Б – наночастицы магнетита (Fe3O4). Размер частиц - 6-12 нм; суммарная площадь сорбционной поверхности наночастиц Sп = 800-1000 м2/г; намагниченность насыщения Is = 2,15 кА/м; объемная концентрация q = 0,00448; вязкостсь h = 1,0112 cSt; физиологический раствор NaCl, который предварительно был обработан наночастицами магнетита (МУС-Б)

Объекты исследования: candida albicans ATCC 885/653, escherichia coli ATCC 25922, pseudomonas aeruginosa ATCC 9027, staphylococcus aureus ATCC 25923, klebsiella pneumonia ATCC 700603.

Методы исследования. Интенсивность свободно радикального перекисного окисления (СРПО) измерялась с помощью метода хемилюминесценции на квантометрической установке ННЦ ХФТИ с ФЭУ -140 [5]. Исследуемый объект помещался в термостатируемую при 37оС кювету, которая во время измерения располагалась над торцом катода ФЭУ. Собственные шумы ФЭУ лежали в пределах 30-70 имп/с. Были использованы различные виды хемилюминесцентных реакций, что позволяло судить о природе различных кислородосодержащих продуктов свободнорадикального перекисного окисления. Хемилюминесцентное определение супероксидного анион-радикала выполнялось в системе люминол + бактериальные среды. В термостатируемую кювету хемилюминометра помещалось 1,5 мл 0,075% люминола + 0,25 мл бактериальной среды + 0,25 мл 0,1% р-ра наночастиц магнетита. Индуцирование проводили 0,05 мл 3% р-ра Н2О2. Интенсивность СРПО определялась на 3 этапах: I этап - определялась I макс, II этап - I конеч., III этап – cветосумма ∑.

Методика микробиологического исследования. С суточной культуры микроорганизмов, выращенной на агаре Мюллер-Хинтона, делали микробную взвесь в физиологическом растворе NaCl по шкале McFarland, соответствующую 0,5 единиц (1,5х108 КОЕ/мл). Затем исходную концентрацию культуры титровали до рабочей концентрации, соответствующей 104. Высев S. aureus осуществлялся на среду Мюллер-Хинтона; E. coli – на среду Эндо. Бактериостатический эффект изучался в следующих вариантах: 1 вариант - контроль; 2 вариант – изучение бактериостатического действия наночастиц магнетита (МУС-Б) после кратковременного их контакта микроорганизмами; 3 вариант - после 24 часового контакта микроорганизмов с МУС-Б; 4 вариант – после 24 часового контакта микроорганизмов с физиологическим р-ром NaCl, который предварительно был обработан МУС-Б. Оценка проводилась в сравнении с контролем.

Полученные результаты были статистически обработаны методом вариационной статистики сравнения средних значений по t-критерию Стъюдента.

 

Результаты исследования.

Результаты исследования интенсивности СРПО в различных бактериальных средах представлены в таблице 1. 

I макс. – интенсивность первой вспышки свечения (ипм/с) после введения индуцента (Н2О2) на первой минуте измерения после термостатирования. Значение максимума первой вспышки позволяет судить об общем количестве продуктов перекисного окисления в субстрате.

I конеч. – конечная интенсивность свечения (ипм/с) по истечению 4 минут. Этот показатель соответствует количеству оставшихся непрореагировавших продуктов перекисного окисления или количеству антиоксидантов.

∑ - светосумма за 4 минуты измерения. Этот показатель указывает на скорость расходования свободных радикалов липидной природы вследствие их взаимодействия с природными атиоксидантами. 

Данные таблицы 1 показывают, что интенсивность первой вспышки свечения, после введения индуцента (I макс.), у всех изучаемых микроорганизмов после обработки наночастицами магнетита, достоверно (p<0,001) снижалась в 2-2,5 раза в сравнении с контролем. Это связано с уменьшением общего количества продуктов перекисного окисления липидов в результате их сорбции наночастицами магнетита [5]. Однако, уже на II этапе достоверных различий показателя I конеч. в сравнении с контролем у микроорганизмов Candida albicana, E. Coli и P. aeruginosa не выявлено (p>0,05). У S. aureus напротив, показатели I конеч. продолжали достоверно (p<0,001) отличаться от контроля. Данный факт свидетельствует о том, что сорбционная активность наночастиц магнетита в бактериальной среде S. aureus, является более значимым физическим фактором действия, чем влияние постоянного магнитного поля.

  III этап исследования (определение ∑ - светосуммы за 4 минуты) демонстрирует, что после обработки бактериальных сред наночастицами магнетита скорость расходования свободных радикалов липидной природы достоверно снижается у всех исследуемых микроорганизмов. Это связано с тем, что эффект сорбции дополняется действием магнитного поля наночастиц. Индуцируемое постоянное магнитное поле (напряженностью 300-400 кА/м) депротонирует (переводит в активное состояние) ферменты антирадикальной защиты. В результате, блокируется образование липоперекисей и вторичных радикалов, ингибируются реакции перекисного окисления липидов [6].

Показатели снижения интенсивности свободно радикального перекисного окисления в бактериальных средах были дополнены данными изучения бактериостатического действия наночастиц магнетита (рисунок 1). 

Рисунок 1 демонстрирует, что в бактериальных средах E. Coli и K. pneumoniae максимальный бактериостатический эффект был выявлен после 24 часовой экспозиции наночастиц магнетита с микроорганизмами. Это проявилось существенным уменьшением количества выросших колоний на питательной среде. В бактериальной среде S. aureus максимальное бактериостатического действия было выявлено в варианте кратковременного контакта микроорганизмов с наночастицами. Если во втором и третьем вариантах механизм бактериостатического действия можно объяснить с позиции сорбционной активности наночастиц, то в 4 варианте, где микроорганизмы контактировали только с физиологическим р-ром NaCl, который предварительно был обработан наночастицами, сорбционное действие исключалось. Механизм данного эффекта объясняется тем, что наночастицы магнетита увеличивают подвижность протонов водорода и меняют их пространственную ориентацию. В результате чего, модифицируется поляризационная структура водной среды клетки и изменяется ее проницаемость [7]. Таким образом, выявленный эффект бактериостатического действия физиологического р-ра NaCl, который предварительно был обработан наночастицами магнетита объясняется механизмом модификации поляризационной структуры водной среды микроорганизма.

Если проанализировать все полученные данные исследований, то можно прийти к заключению, что варианты выраженности бактериостатического действия коррелируют с показателями изучения интенсивности СРПО. Так, максимальный бактериостатический эффект у S. aureus сильнее всего был выражен во 2 варианте применения наночастиц магнетита, где механизм сорбции превалировал над действием магнитного поля. Напротив, у Е. сoli и K. pneumoniae максимальный бактериостатический эффект был выявлен в 3 варианте, где время экспозиции контакта наночастиц с микроорганизмами было определяющим. Достоверно полученные данные о бактериостатическом действии физиологического раствора NaCl, который предварительно был обработан наночастицами магнетита, подтверждают силу влияния магнитного поля наночастиц на структуру воды.

Таким образом, в результате проведенных исследований по изучению влияния основных физических факторов наночастиц магнетита (постоянного магнитного поля и сорбции) на различные микроорганизмы установлено, что оба фактора оказывают воздействие на микроорганизмы, но достоверно определяющее влияние того, или иного фактора зависит от индивидуальных особенностей микроорганизма.

 

Выводы:

  1. Расширен спектр изучения механизмов влияния физических факторов наночастиц магнетита на микроорганизмы путем исследования реакций интенсивности СРПО и бактериостатического действия.
  2. Достоверно установлено, что наночастицы магнетита в разных микроорганизмах вызывают неодинаковую по интенсивности реакцию СРПО.
  3. Выявлено, что у микроорганизмов Candida albicana, E. Coli и P. aeruginosa более значимым влиянием на показатели I конеч. является действие магнитного поля, которое индуцируется наночастицами. Напротив, у S. aureus, более значимым был механизм сорбции.
  4. Установлено, что у всех микроорганизмов после их контакта с наночастицами магнетита скорость расходования свободных радикалов липидной природы достоверно снижалась.
  5. В результате контакта наночастиц магнетита с микроорганизмами (E. Coli, K. pneumoniae и S. aureus) возникает бактериостатический эффект. Визуально, это проявилось достоверным уменьшением количества выросших колоний на питательной среде.
  6. Установлено, что физиологический раствор NaCl, который предварительно обработан наночастицами магнетита также достоверно вызывает бактериостатический эффект в исследованных микроорганизмах. Основная причина данного эффекта связана с изменением поляризационной структуры водных сред наночастицами магнетита.
  7. Выявлено, что варианты выраженности бактериостатического действия коррелируют с данными реакций интенсивности СРПО. Максимальный бактериостатический эффект у S. aureus сильнее всего выражен в 1 варианте применения наночастиц магнетита, где механизм сорбции был более значим, чем действие магнитного поля. Напротив, у Е. Coli и K. pneumoniae максимальный бактериостатический эффект был выявлен в 3 варианте, где время экспозиции контакта наночастиц с микроорганизмами, а, следовательно, и действие магнитного поля было определяющим.

 

Список литературы:

[1]. http://www.bbc.com/news/health-21737844

[2]. Belousov A.N., Osolodchenko T.P., Belousova Ye.Yu. Effects of magtietic fluid preparations on microorganisms // Eighth International Conference on magnetic fluids. - Timisoara, Romana. 1998. - P. 486-487.

[3]. Belousov A. The Role of Magnetite Nanoparticles (ICNB) in Discovery New Factor Which Influence on Permeability of Erythrocytes and Eryptosis. OALib Journal is an all-in-one open access journal (ISSN Print: 2333-9721, ISSN Online: 2333-9705) DOI: 10.4236/oalib.1101055, pp. 1-6. (http://www.oalib.com/articles/3126453#.VGSZf8n-s0s)

[4]. Gerasimov A.M, Kornev E.N, Amelin D.Sh. Modeling the relationship of peroxide generating and NADPH - dependent processes. Oxidative enzymes of animal cells and the regulation of their activity. Symp. of Russia. Gorkiy. - 1978. - p. 23-24.

[5]. Belousov A. Effect of extracorporeal hemocorrection with using magnet-controlled sorbent on the intensity of lipid peroxidation. Experimental and Clinical Medicine. Kharkov State Medical University, 2001. - №1. – P. 113-115.

[6]. Belousov A. The extracorporal hemocorrection with application of magnet-controlled sorbent in intensive therapy of syndrome intoxication in the patients with a pathology hepatopancreatoduodenum zones: The abstract dissertation of doctor medicine: 14.01.30. / The Dnepropetrovsk state of medical academy, 2004. - 40 p.

[7]. Belousov A. Inhibition of Eryptosis by Means of Magnetite Nanoparticles (MCS-B). International Journal of Advance in Medical Science (AMS) Volume 2, 2014. ISSN: 2327-7238. P. 19-23.

 


© 2008 — 2019 «Лаборатория прикладных нанотехнологий»
Разработка и поддержание сайта - seozavr.com