ВЛИЯНИЯ НАНОЧАСТИЦ МАГНЕТИТА НА ПРОНИЦАЕМОСТЬ ЭРИТРОЦИТОВ И ЭРИПТОЗ. ОТКРЫТИЕ НОВЫХ МЕХАНИЗМОВ ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ КЛЕТОК.

Andrey N. Belousov

 

 

Abstract. This paper presents original research studying the effects of biocompatible nanoparticles standardized (ICNB) on the permeability of erythrocytes and eryptosis. The presented evidence demonstrates that changing orientation and mobility protons of the hydrogen atoms in the pericellular fluid significantly modify the permeability and physiological activity of erythrocytes. The leading role of the state of cell membrane and transport activity enzymes (ATPase) in ensuring its permeability and functional activity is exaggerated. Magnetite nanoparticles (IСNB) act on the fluid of pericellular structure by changing the orientation and mobility of hydrogen protons that ultimately determines the permeability, and physiological activity of cells.

Keywords: nanoparticles of  ICNB, permeability, physiological activity, erythrocytes, mobility of protons of the hydrogen atoms, eryptosis.

Резюме. В работе представлены оригинальные исследования изучения влияния биосовместимых стандартизированных наночастиц ИКНБ на проницаемость эритроцитов и эриптоз. Представлен доказательный опыт демонстрирующий, что изменения ориентации и подвижности протонов атома водорода в околоклеточной жидкости достоверно модифицируют проницаемость и физиологическую активность эритроцитов. Лидирующая роль состояния мембраны клетки и активности транспортных ферментов (АТФаз) в обеспечении ее проницаемости и функциональной активности, преувеличена. Наночастицы магнетита (ИКНБ) воздействуют на структуру околоклеточной жидкости путем изменения ориентации и подвижности протонов атома водорода, что, в конечном счете, определяет проницаемость и физиологическую активность клетки.

Ключевые слова: наночастицы ИКНБ, проницаемость, физиологическая активность, эритроциты, подвижность протонов атома водорода, эриптоз.

 

Актуальность. Метаболическая реставрация, продление нормального функционирования клеток, как внутри, так и вне организма – основная задача медико-биологического направления XXI века. Станет ли возможным в ближайшее будущее целенаправленно управлять клеточным метаболизмом, лечить ранее неизлечимые заболевания и т.д.? Какими для этого должны быть инструменты и методы? На все эти вопросы может дать ответ современное направление науки – нанотехнология [1]. Заблуждение рассматривать нанопрепараты только с позиций фармакологии. Прежде всего, наночастицы - это наноинструмент, с помощью которого можно оказывать влияние на молекулярные среды вне- и внутриклеточных пространств, изменять их, изучать новые реакции и механизмы клеточного метаболизма. Это ключ к открытию и пониманию процессов функционирования клетки, ее жизни и смерти а, следовательно, и организма в целом. Ранее проведенный комплекс исследований по изучению влияния на клеточный метаболизм препаратов нанотехнологии показал, что в целом стандартизированные биосовместимые формы наночастиц магнетита (Микромаг-Б, МУС-Б, ИКНБ) оказывают неспецифическое модулирующее действие на обменные процессы. Достоверно установлено, что наночастицы магнетита эффективно модулируют метаболические процессы в лейкоцитах, регулируют активность ферментного звена антиоксидантной системы в эритроцитах здоровых и больных людей [2,3]. В эксперименте доказано, что в результате ультраструктурных исследований органов ретикуло-эндотелиальной системы (печени, легких и почек) внутривенное введение биосовместимых форм наночастиц магнетита вызывает неспецифическую активацию обменных процессов, повышение адаптационно-приспособительных механизмов и потенциальных возможностей органелл клеток, ускорение репаративных процессов на уровне мембран и макромолекул [4,5]. Наличие сорбционного и непрямого (магнитного) эффектов позволяют наночастицам магнетита не только селективно сорбировать поверхностные белки мембран клеток (по принципу магнитофереза), но и предотвращать окислительную модификацию белков путем стабилизации активных групп, нормализовывать состояние рецепторов, которые локализованы на поверхности мембран клеток, повышать активность мембраносвязанных ферментов [6,7]. Последние научные работы, связанные с применением наночастиц магнетита (ИКНБ) в качестве контрастного средства при МРТ злокачественной опухоли достоверно показали, что наночастицы вызывают обратимые изменения, связанные с временным увеличением подвижности протонов водорода в околоклеточной жидкости, что неизбежно модифицирует обмен в злокачественных клетках [8]. Результаты этих исследований не только расширили понимание механизмов действия наночастиц на состояние вне - и внутриклеточных пространств, но и позволили выявить новые аспекты клеточного обмена, определить роль мембраны и клеточных ферментов в регуляции метаболических процессов [9].

Исходя из вышеизложенного, актуальным продолжением научной работы стало изучение влияния наночастиц магнетита на механизм проницаемости клетки. Необходимо было найти ответы на следующие вопросы: почему сорбция наночастицами магнетита поверхностных белков c мембран эритроцитов не только повышает их устойчивость к разрушению, но и продлевает сроки функциональной активности клеток крови, в несколько раз увеличивает время их хранения?

Цель исследования: изменить проницаемость клетки с помощью стандартизированных биосовместимых наночастиц магнетита (ИКНБ).

Для выполнения цели поставлены задачи:

  1. В эксперименте in vitro создать простую модель демонстрирующую проницаемость клетки.
  2. Представить доказательные данные об изменении проницаемости клетки.
  3. Исследовать различные варианты сред воздействующих на внеклеточное пространство.
  4. Выстроить последовательную цепочку преемственности полученных научных данных с ранее выявленными. 

 

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 

 В качестве наночастиц был взят стандартизированный интракорпоральный нанобиокорректор марки ИКНБ [10]. Основные физико-химические свойства ИКНБ:

- концентрация коллоидного раствора наночастиц магнетита в физиологическом растворе NaCl 0,0225%;

- теоретическая осмолярность 500 мОсм/л;

- размер наночастиц магнетита 6-12 нм;

- суммарная площадь поверхности наночастиц магнетита Sп = 800-1200 м2/г;

- намагниченность насыщения Is = 2,15 кА/м;

ζ – потенциал = - 19 мВ.

Перед началом проведения основного опыта на МР-томографе проводилась визуальная оценка сравнения яркости изображения применяемых в опыте жидких сред: ИКНБ, физиологического раствора NaCl и физиологического раствора NaCl, который предварительно был обработан ИКНБ. Исследования проводились на МР-томографе «Magneton Concerto» фирмы Siemens  с напряженностью магнитного поля 0,2 Тесла.

Получали аксиальные томограммы:

  1. Т1 – взвешенные последовательности Спин Эхо TR 50 мс, TE 17 мс поле обзора 250 мм, толщина среза 2 мм.
  2. Т2 - взвешенные последовательности Градиент Эхо TR 500 мс, TE 17 мс поле обзора 180 мм, толщина среза 4 мм.

Материалом изучения проницаемости клеток были эритроциты венозной крови здорового человека. Кровь по 2 мл распределялась в 4 пробирки с цитратом. Внеклеточное пространство моделировалось путем добавления в пробирки физиологического раствора NaCl. Распределение пробирок было следующим:

Пробирка I: 2 мл крови + 1мл. 0,9% р-р NaCl.

Пробирка II: 2 мл крови + 1мл. 0,9% р-р NaCl + 1 мл. дист. H2O.

Пробирка III: 2 мл крови + 1мл. 0,9% р-р NaCl, который предварительно был обработан ИКНБ + 1 мл. дист. H2O.

Пробирка IY: 2 мл крови + 1мл. 0,9% р-р NaCl + 1 мл. ИКНБ + 2 мл. дист. H2O.

Изменение проницаемости мембран эритроцитов определяли визуально и микроскопически, регистрируя признаки гемолиза.

Исследования проводили на двух этапах: через час и на 10 сутки.

  

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

 

Результаты визуальной оценки яркости изображения при МРТ исследовании применяемых в опыте жидкостей представлены на рисунке 1. 

Рис. 1. Изображения жидких сред используемых в опыте при МРТ исследовании.

Рисунок 1 демонстрирует разницу яркости изображения сравниваемых жидкостей при МРТ исследовании. Иерархия увеличения яркости изображения выстроилась в следующем порядке: ИКНБ, физиологический раствор NaCl,  физиологический раствор NaCl обработанный наночастицами ИКНБ. Разница яркости изображений при МРТ исследовании различных жидкостей объясняется следующим:

В варианте 1.  Наночастицы магнетита ИКНБ уменьшают подвижность протонов водорода в жидкости носителе (0,9% р-р NaCl). Поэтому, яркость изображения при МРТ исследовании максимально низкая.

В варианте 2. Повышенная подвижность протонов водорода в интактном 0,9% растворе NaCl увеличила яркость изображения в сравнении с первым вариантом.

В варианте 3. Подвижность протонов водорода в 0,9% растворе NaCl, который был предварительно обработан наночастицами ИКНБ, максимальна. Поэтому, яркость изображения значительно выше, чем в предыдущих вариантах.

Таким образом, предварительно проведенный эксперимент наглядно демонстрирует то, что наночастицы магнетита ИКНБ изменяют подвижность и ориентацию атомов водорода в жидкостях, что достоверно регистрируется при визуальной оценке МРТ исследования.

Следующий комплекс исследований был основным и направлен на изучение изменения проницаемости клетки посредством модификации подвижности и пространственной ориентации протонов водорода в околоклеточной жидкости с помощью наночастиц магнетита ИКНБ.

Результаты визуальной оценки состояния проницаемости эритроцитов при различных вариантах воздействия представлены на рисунке 2. 

Рис.2. Визуальная оценка состояния  проницаемости  эритроцитов при различных вариантах воздействия на состояние внеклеточной жидкости через час после взятия крови.

 Рисунок 2 демонстрирует, что через час после начала проведения опыта коллоидно-суспензионная система крови под воздействием гравитации расслаивается, и появление красноватой окраски плазмы свидетельствует о явлениях гемолиза.

Так, в первой пробирке (контроль), через час после добавление в венозную кровь физиологического раствора NaCl, плазма крови была светло желтого цвета. Данный факт свидетельствовал об отсутствии гемолиза. Нормальный размер эритроцитов при микроскопическом исследовании свидетельствовал об изотоничности введенного раствора.

Во второй пробирке, где в кровь на фоне физиологического раствора добавлялась дистиллированная вода, плазма приобрела красноватый оттенок. Микроскопически размер эритроцитов был резко увеличен. Местами определялись разрушенные клетки. Причина разрушения клеток вызвана повышением их проницаемости в результате снижения осмолярности околоклеточной жидкости. В избыточном количестве околоклеточная вода приникает в эритроцит и разрушает его. Выход из эритроцитов свободного гемоглобина окрашивает плазму в красноватый цвет.  

В третьей пробирке, где физиологический раствор был предварительно обработан наночастицами магнетита ИКНБ, добавление дистиллированной воды не вызвало изменения цвета плазмы. Микроскопически размер эритроцитов оставался без изменений.

В четвертой пробирке, где в кровь с физиологическим раствором добавлялся ИКНБ введенная дистиллированная вода также, как и в третьей пробирке не вызвала патологических изменений со стороны цвета плазмы и размеров эритроцитов.

Следующий этап исследования (II этап) проводился на 10 сутки наблюдения с момента взятия крови. Визуальная оценка состояния проницаемости эритроцитов при различных вариантах воздействия на II этапе исследования (10 сутки) представлена на рисунке 3.

Рис.3. Визуальная оценка состояния  проницаемости  эритроцитов при различных вариантах воздействия на состояние внеклеточной жидкости на 10 день.

 Рисунок 3 демонстрирует, что на 10 сутки исследования часть белков плазмы под воздействием сил гравитации осаждается, и появляется более прозрачная сыворотка крови.

В первой пробирке (контроль) нижний слой сыворотки был окрашен в ярко красный цвет. Данный факт свидетельствует о наличии в сыворотке свободного гемоглобина. Микроскопически размер эритроцитов был резко увеличен. В большом количестве определялись разрушенные клетки. Причиной начала тотального разрушения клеток стало нарушение их проницаемости в результате активации эриптоза.

Во второй пробирке, где в кровь на фоне физиологического раствора добавлялась дистиллированная вода, также нижний слой сыворотки был окрашен в ярко красный цвет. Появление ярко красного цвета в нижнем слое сыворотки (как и в контроле) свидетельствует о наличии свободного гемоглобина. Микроскопически размер эритроцитов был резко увеличен. В большом количестве определялись разрушенные клетки. Причиной начала тотального разрушения клеток стало не только нарушение их проницаемости в результате активации эриптоза, но и в результате низкой  осмолярности околоклеточной жидкости. 

В третьей пробирке с кровью, где физиологический раствор был предварительно обработан наночастицами магнетита ИКНБ и добавлена дистиллированная вода, на 10-е сутки исследования изменений в окраске сыворотки не обнаружено.

В четвертой пробирке, где в кровь с физиологическим раствором добавлялись ИКНБ и дистиллированная вода так же, как и в третьей пробирке, патологических изменений со стороны цвета сыворотки и размеров эритроцитов не обнаружено.

 Полученные результаты исследований в 3 и 4 пробирках наглядно демонстрируют не только выраженный эффект устойчивости клеток крови для проницаемости дистиллированной воды, но и ингибирование эриптоза.

Таким образом, изменение ориентации и подвижности протонов атома водорода в околоклеточной жидкости, в данном случае, явился  определяющим для проницаемости и физиологической активности клеток крови. Следовательно, существующее мнение о главенствующей роли состояния мембраны клетки и активности транспортных ферментов (АТФаз) в обеспечении ее проницаемости и функциональной активности, преувеличено.

Проведенный эксперимент с применением наночастиц магнетита (ИКНБ) наглядно демонстрирует, что проницаемость клетки в первую очередь определяется состоянием структуры околоклеточной жидкости. Изменив структуру околоклеточной жидкости, мы изменяем проницаемость клетки и ее физиологическую активность. Данные исследования подтверждают теории «ассоциации-индукции» и «многослойной организации поляризованной воды» Г. Линга [11].

 

ВЫВОДЫ 

  1. Наночастицы магнетита ИКНБ уменьшают подвижность протонов водорода в жидкости носителе (0,9% р-р NaCl), что регистрируется максимально низкой яркостью изображения на МРТ.
  2. В обработанном наночастицами ИКНБ физиологическом растворе NaCl меняются ориентация и подвижность протонов водорода, что характеризуется  увеличением яркости изображения на МРТ.
  3. Достоверно установлено, что изменение ориентации и подвижности протонов атома водорода в околоклеточной жидкости модифицирует проницаемость и физиологическую активность клеток крови.
  4. Наночастицы магнетита ИКНБ и физиологический раствор NaCl, который предварительно обработан ИКНБ не только изменяют проницаемость клеток крови, но и ингибируют эриптоз.
  5. Лидирующая роль состояния мембраны клетки и активности транспортных ферментов (АТФаз) в обеспечении ее проницаемости и функциональной активности, преувеличена.
  6. Открыт новый фактор, влияющий на проницаемость эритроцитов и эриптоз.

  

ЛИТЕРАТУРА

 

  1. http://nanolab.com.ua/abstracts.html
  2. Белоусов А.Н. Белоусова Е.Ю. Первые шаги на пути к открытию механизмов клеточной регуляции препаратами нанотехнологии // Тр. X Международной конференции «Новые информационные технологии в медицине и экологии», Ялта-Гурзуф, 2002. – С.420-425.
  3. Белоусов А.Н. Влияние магнитоуправляемого сорбента на параметры кислото-щелочного состояния крови и процессы гликолиза в эритроцитах. Біль, знеболювання і інтенсивна терапія. - Київ. – 2000. - .№1. С. 263-265.
  4.  Белоусов А.Н., Невзоров В.П. Ультраструктура клеток почек и легких кроликов после введения магнетита // Международный сборник научных трудов 4 научно-практической конференции по созданию и апробации новых лекарственных средств. - Москва, 1997, т.4. - С. 77-87.
  5. Белоусов А.Н., Невзоров В.П. Ультраструктура клеток печени после введения магнетита // Международный сборник научных трудов 4 научно-практической конференции по созданию и апробации новых лекарственных средств. - Москва, 1997, т.4. - С. 71-77.
  6. Belousov A.N. Spectrum of Application Magnetite Nanopaticles in Medicine. Nanotech 2009. Vol. 2 Chapter 3, pp.154 – 157. - ISBN: 978-1-4398-1783-4
  7. Белоусов А.Н. Влияние наночастиц магнитоуправляемого сорбента (МУС-Б) на гемолиз и транспортную активность АТФазы эритроцитов. Біль, знеболювання і інтенсивна терапія. - Київ. – 2012. - №1(д). С. 26-28
  8. Belousov A.N. Application Magnetite of Nanoparticles (ICNB Preparation) as Magnetically-Resonant Contrasting Means During Visualization of Tumours. Clean Technology and Sustainable Industries Organization, 2013. Chapter 10, p 379-381
  9. Белоусов А.Н. Исследование влияния наночастиц магнитоуправляемого сорбента (МУС-Б) на функциональную активность эритроцитов. Перспективи медицини та біології.- ЛДМУ. Том IY, №1, 2012 (д), с. 94-97
  10. www.nanolab.com.ua
  11. Ling Gilbert N. Life at the cell and below-cell level: the hidden history of a fundamental revolution in biology. - Sankt-Peterburg: Science, 2008. - 376 p.

 


© 2008 — 2019 «Лаборатория прикладных нанотехнологий»
Разработка и поддержание сайта - seozavr.com