ВЛИЯНИЕ ПРЕПАРАТОВ НАНОТЕХНОЛОГИИ НА КЛЕТОЧНЫЙ МЕТАБОЛИЗМ
Белоусов А.Н.
«Тот, кто раньше овладеет нанотехнологией, займет ведущее
место в техносфере будущего»
Э. Теллер
Актуальность
Синтез и изучение препаратов нанотехнологии в XXI столетии приобретает высокую степень актуальности. “Nano” - в переводе с греческого - «карлик», - 1 млрд. доля метра. Развитие такого рода технологий позволит создать молекулярных роботов-врачей, которые способны "жить" внутри человеческого организма и устранять или предотвращать повреждения, включая генетические, механизмы старения клеток, способствовать восстановлению тканей человеческого организма, излечению безнадежно больных людей [9]. В настоящий момент официально в Украине зарегистрированы следующие препараты нанотехнологии: «Микромаг - Б» и магнитоуправляемый сорбент МУС-Б [2, 3]. Основу данных препаратов составляют наночастицы магнетита (Fe3O4) размером от 6 до 12 нм. Несмотря на проведенный комплекс клинико-биохимических исследований, до сих пор остаются не изучены механизмы действия коллоидных частиц магнетита на уровне внутриклеточных метаболических процессов [6, 7].
Цель работы
Изучить механизмы действия коллоидных частиц магнетита на уровне внутриклеточного метаболизма.
Материалы и методы
Материал исследования: коллоидные частицы магнитоуправляемого сорбента (МУС-Б) и ферроколлоид, необладающий магнитными свойствами. Основу МУС-Б составил магнетит (Fe3O4). Размер коллоидных частиц магнетита был в пределах от 6 до 12 нм.
Объект исследования: эритроциты и лейкоциты крови человека.
Всего обследовано: 80 человек. Из них: 1) Продукты клеточного обмена лейкоцитов определялись у 28 человек: практически здоровые – 12 человек; больные с синдромом интоксикации на фоне полиорганной недостаточности – 10 человек; терминальные больные – 6 человек. 2) Показатели свободнорадикального окисления липидов в эритроцитах исследовались у 42 человек: практически здоровые – 21 человек; больные вирусным гепатитом С – 21 человек.
Изучение клеточного метаболизма в лейкоцитах включало: определение содержания гликогена, активности сукцинат дегидрогеназы (СДГ), содержания общего белка [1]; активности Гл-6Ф-ДГ, определение активности лактатдегидрогеназы (ЛДГ), концентрации креатинина [5]; активности супероксиддисмутазы (СОД), активности каталазы, содержания глютатиона восстановленного, концентрации ДК и МДА [4].
Гемолизат эритроцитов для определения активности ферментов получали согласно методике [8].
Исследования включали два этапа: определение перечисленных параметров в интактных клетках и клетках после обработки магнитоуправляемым сорбентом.
Результаты и их обсуждение
В результате исследования лейкоцитов практически здоровых людей после обработки крови коллоидными частицами магнетита (МУС-Б) выявлено: снижение содержания гликогена на 19±0,3 мг/1010 кл (р<0,001); общих липидов – на 6,1±0,5 мкг/106 кл (р<0,001); снижение активности Гл-6Ф-ДГ - 302,4±11,2 ммоль/1чх1011 кл (исходная 500±10,6 ммоль/1чх1011 кл), (р<0,001); увеличение содержания фосфолипидов - на 0,9±0,1 мг/106 кл (р>0,05); общего белка – на 8,0±0,5 мкг/1010 кл (р<0,001); концентрации креатинина – на 1,29±0,1 мг/109 кл (р>0,05); активности глютатиона (восст.) – 4,2±0,1 мг/1010 кл. (исходная - 3,2±0,1 мг/1010 кл), (р<0,001); активности гексокиназы – 11,4±0,2 ммоль/1ч х1011 кл. (исходная - 9,5±0,2 ммоль/1чх1011 кл), (р<0,001); лактатДГ – 611±11,4 ммоль/1чх1011 кл (исходная - 542±10,5 ммоль/1чх1011 кл), (р<0,001); сукцинатДГ – 6,9±0,2 ммоль/1чх1011 кл (исходная - 3,8±0,1 ммоль/1ч х1011 кл), (р<0,001); концентрации МДА – на 7,7±0,7 нмоль/мг (р<0,001); ДК – на 66,8±10,5 нмоль/мг (р<0,001); активности СОД – 0,18±0,04 МЕх106 кл/ч (исходная - 0,08±0,02 МЕх106 кл/ч), (р>0,05).
У больных с синдромом эндогенной интоксикации на исходном этапе исследования в лейкоцитах отмечены признаки угнетения метаболических процессов, что проявлялись: снижением содержания фосфолипидов – на 0,4±0,1мкг/10 6 кл; общего белка – на 3,9 ±0,3 мкг/1010 кл; общих липидов – на 8,3±0,6 мкг/106 кл; возрастанием концентрации креатинина – на 2,09±0,2 мг/109 кл.
После обработки крови МУС-Б в лейкоцитах отмечено увеличение содержания фосфолипидов – на 1,8±0,1мкг/106 кл (р<0,001); общего белка – на 15,3±0,1мкг/1010 кл (р<0,05); концентрации креатинина – на 0,7±0,1мг/106 кл (р>0,05); уменьшение содержания общих липидов – на 15,6±0,1мкг/106 кл (р<0,001). Данные изменения свидетельствовали о восстановлении метаболических процессов в клетке.
У терминальных больных на исходном этапе исследования в лейкоцитах отмечены аналогичные признаки угнетения метаболических процессов, однако, в более выраженной форме.
В результате обработки крови коллоидными частицами магнетита (МУС-Б) признаков восстановления показателей клеточного метаболизма не обнаружено. Так, концентрация креатинина не повышалась, а снижалась – на 0,4±0,1 мг/109 кл (р>0,05); активность лактатДГ снижалась – 330±10,9 ммоль/1чх1011 кл (исходная - 348±12,1 ммоль/1чх1011 кл), (р>0,05); сукцинатДГ – 1,6±0,1 ммоль/1чх1011 кл (исходная – 2,0±0,2 ммоль/1чх1011 кл), (р>0,05); содержание ДК снижалось – на 5,6±10,5 нмоль/мг (р>0,05); активность СОД не изменялась (р>0,05). Уменьшение активности сукцинатДГ, вероятно, обусловлено дефицитом кислорода и дестабилизацией мембран, а стабильность активности супероксиддисмутазы (СОД), возможно, свидетельстует о несостоятельности процессов антирадикальной защиты (см. табл. 1).
Таким образом, у больных с синдромом эндогенной интоксикации после обработки крови коллоидными частицами магнетита (МУС-Б) отмечен процесс восстановления регуляторных механизмов клеточного метаболизма. Нормализация уровня ПОЛ и показателей антиоксидантной системы (АОС) свидетельствовали о снятии окислительного стресса.
Напротив, у терминальных больных после обработки крови коллоидными частицами магнетита, процесс восстановления клеточного метаболизма не выявлен. Возможно это объясняется высоким уровнем эндогенной интоксикации, повреждением мембранного аппарата клеток, истощением метаболических субстратов.
Универсальность действия коллоидных частиц магнетита (МУС-Б) на процессы клеточной регуляции подтвердилась в исследованиях активности ферментов антирадикальной защиты у практически здоровых и больных людей на вирусный гепатит С.
Все обследуемые были разделены по группам в зависимости от исходных показателей состояния АОС (см. табл. 2).
Установлено, что у всех исследуемых после обработки крови коллоидными частицами магнетита (МУС-Б) модулируется активность антиоксидантной системы (АОС) эритроцитов (СОД, каталазы и глютатиона).
Так, в 11 (26,2%) человек практически здоровых людей после обработки эритроцитов МУС-Б отмечено: увеличение активности глютатиона – 4,9±0,2 мгх1010 кл. (исходная - 3,7±0,1 мгх1010 кл), (р>0,05); активности СОД – 0,26±0,01 МЕх106 кл/ч (исходная - 0,17±0,01 МЕх106 кл/ч), (р<0,001); активности каталазы – 6,2±0,1 мккатал х1010 кл. (исходная - 5,4±0,1 мккатал х1010 кл), (р<0,001).
В 9 (21,4%) человек увеличение активности глютатиона и каталазы не отмечалось (р>0,05). Активность СОД уменьшалась – 0,09±0,01 МЕх106 кл/ч (исходная - 0,11±0,01 МЕх106 кл/ч), (р<0,001).
В 12 (28,5%) человек отмечено: увеличение активности глютатиона - 4,5±0,1 мгх1010 кл (3,5±0,1 мгх1010 кл), (р<0,001); активности каталазы - 5,9±0,1мккатал х1010 кл (исходная - 5,5±0,1мккатал х1010 кл), (р<0,01); уменьшение активности СОД – 0,07±0,02 МЕх106 кл/ч (исходная - 0,10±0,02 МЕх106 кл/ч), (р>0,05).
В 10 (23,8%) человек увеличение активности глютатиона – 4,4±0,2 мгх1010 кл (исходная - 4,1±0,2 мгх1010 кл), (р>0,05); активности СОД – 0,18±0,02 МЕх106 кл/ч (исходная - 0,15±0,02 МЕх106 кл/ч), (р>0,05); активность каталазы уменьшалась – 5,3±0,1 мккатал х1010 кл (исходная - 5,7±0,1 мккатал х1010 кл), (р<0,01).
Аналогичный процесс коррекции показателей уровня активности ферментов антирадикальной защиты при различных исходных вариантах, также отмечен и у больных с вирусным гепатитом С (см. табл.2).
Вероятно, действие коллоидных частиц магнетита обусловлено, с одной стороны, свойствами коллоидных частиц магнетита (МУС-Б) селективно сорбировать белковые молекулы с поверхности мембран клетки [10]; с другой , возможно , изменением конформационной структуры поверхностных белков мембран посредством магнитного поля, индуцируемого частицами магнетита.
С целью изучения сорбционной активности ферроколлоид а и МУС-Б относительно поверхностных белков мембран исследовались эритроциты практически здоровых людей.
В результате исследования установлено: ферроколлоид сорбирует спектрин на 11±1% ( p<0,001), анкирин – на 1±0,5% ( p >0,05); коллоидные частицы МУС-Б сорбируют спектрин - на 7±1% ( p <0,001), анкирин – на 3±0,5% ( p <0,001) (см. рис.1).
Таким образом, ферроколлоид и магнетит обладают различной сорбционной активностью относительно поверхностных белков мембран клеток. Однако следует напомнить, что ферроколлоид «слепо» сорбирует белковые молекулы , что несомненно нарушает целостность мембраны клетки. В отличие от ферроколлоида МУС-Б обладает селективными свойствами сорбции основанном на принципе магнитофереза, а поэтому в целом не вызывает нарушений структурной целостности мембран клеток, а лишь количественно изменяет состав белковых молекул.
Заключение: В данной работе впервые систематизированы результаты исследований действия коллоидных частиц магнетита (МУС-Б) на механизмы клеточной регуляции. Установлено, что точкой их приложения являются поверхностные белки мембран клеток.
Таким образом, мы предполагаем, что в основе биологического действия препаратов нанотехнологии лежит их влияние на конформацию и состав белковых молекул цитоплазмы и внутриклеточных мембран. Изменение состава белковых молекул влияет на транспорт веществ в клетку, что и определяет процессы внутриклеточного метаболизма.
Выводы:
1). Коллоидные частицы магнетита (МУС-Б) выступают в роли модулирующего фактора метаболических процессов в лейкоцитах крови здоровых и больных людей.
2). Обработка эритроцитов коллоидными частицами магнетита (МУС-Б) приводит к избирательной сорбции поверхностных белков мембран клеток.
3). Коллоидные частицы магнетита (МУС-Б) модулируют активность ферментного звена антиоксидантной системы в эритроцитах здоровых и больных людей вирусным гепатитом С.
Таблица 1. Показатели клеточного обмена лейкоцитов у различного рода больных (M±m).
|
Продукты клеточного обмена лейкоцитов
|
Практически здоровые люди (n=12)
|
Больные с синдромом интоксикации на фоне полиорганной недостаточности (n=10)
|
Терминальные больные (n=6)
|
|
Исходные данные
|
После обработки «МУС-Б»
|
P
|
Исходные данные
|
После обработки «МУС-Б»
|
P
|
Исходные данные
|
После обработки «МУС-Б»
|
P
|
|
Гликоген, мг/1010 кл
|
51,4±0,5
|
32,4±0,3
|
<0,001
|
32,3±0,4
|
21,4±0,5
|
<0,001
|
27,6±0,4
|
23,0±0,3
|
<0,001
|
|
Фосфолипиды, мгх106 кл
|
2,5 ±0,2
|
3,4 ±0,1
|
>0,05
|
2,1±0,2
|
3,9±0,1
|
<0,05
|
1,8±0,1
|
1,9±0,2
|
>0,05
|
|
Общий белок, мкгх1010 кл
|
36,2± 0,4
|
44,2±0,5
|
<0,001
|
32,3±0,3
|
47,6±0,5
|
<0,001
|
28,6±0,3
|
29,3±0,4
|
>0,05
|
|
Общие липиды, мкгх106 кл
|
98,1±0,6
|
92,0±0,5
|
<0,001
|
89,8±0,6
|
74,2±0,5
|
<0,001
|
84,6±0,8
|
83,1±0,7
|
>0,05
|
|
Креатинин, мгх109 кл
|
1,01±0,2
|
2,3±0,1
|
>0,05
|
3,1±0,2
|
3,8±0,1
|
>0,05
|
3,4±0,1
|
3,0±0,2
|
>0,05
|
|
Глютатион (восст), мгх1010 кл
|
3,2±0,2
|
4,2±0,1
|
<0,001
|
2,7±0,1
|
4,7±0,2
|
<0,001
|
1,0±0,1
|
1,0±0,2
|
>0,05
|
|
Гексокиназа, ммоль/1чх1011 кл
|
9,5±0,2
|
11,4±0,2
|
<0,001
|
7,7±0,1
|
10,8±0,2
|
<0,001
|
6,3±0,1
|
6,8±0,2
|
>0,05
|
|
Лактат ДГ, ммоль/1чх1011 кл
|
542±10,5
|
611±11,4
|
<0,001
|
467±10,6
|
591±11,1
|
<0,001
|
348±12,1
|
330±10,9
|
>0,05
|
|
Гл-6Ф-ДГ, ммоль/1чх1011 кл
|
500±10,6
|
302,4±11,2
|
<0,001
|
378±10,8
|
187,3±12,0
|
<0,001
|
278,6±10,1
|
211,5±10,3
|
<0,001
|
|
Сукцинат ДГ, ммоль/1чх1011 кл
|
3,8±0,1
|
6,9±0,2
|
<0,001
|
2,7±0,1
|
6,7±0,2
|
<0,001
|
2,0±0,2
|
1,6±0,1
|
>0,05
|
|
МДА, нмоль/мг
|
22,9±0,5
|
30,6±0,7
|
<0,001
|
32,5±0,5
|
34,4±0,7
|
<0,05
|
36,8±0,5
|
37,1±0,6
|
>0,05
|
|
ДК, нмоль/мг
|
190±10,3
|
256,8±10,5
|
<0,001
|
197±11,2
|
261,4±12,1
|
<0,001
|
205,7±10,3
|
200,1±10,7
|
>0,05
|
|
СОД,МЕх106 кл/ч
|
0,08±0,02
|
0,18±0,04
|
>0,05
|
0,12±0,03
|
0,28±0,02
|
>0,05
|
0,22±0,03
|
0,22±0,02
|
>0,05
|
Таблица 2. Показатели активности ферментов антирадикальной защиты в эритроцитах до и после обработки крови «МУС–Б» при различных исходных вариантах (M±m).
|
Варианты
|
Показатели свободнорадикального окисления липидов в эритроцитах крови
|
Практически здоровые люди
|
Больные вирусным гепатитом С
|
|
Исходные данные
|
После обработки «МУС-Б»
|
|
Исходные данные
|
После обработки «МУС-Б»
|
P
|
|
I (n=11)
|
Глютатион,мгх1010 кл
|
3,7±0,1
|
4,9±0,2
|
>0,05
|
3,9±0,2
|
4,8±0,1
|
<0,001
|
|
СОД, МЕх106 кл/ч
|
0,17±0,01
|
0,26±0,01
|
<0,0 01
|
0,08±0,01
|
0,09±0,01
|
>0,05
|
|
Каталаза, мккатал х1010 кл
|
5,4±0,1
|
6,2±0,1
|
<0,001
|
9,2±0,2
|
10,0±0,1
|
<0,001
|
|
II (n=9)
|
Глютатион,мгх1010 кл
|
4,7±0,1
|
4,7±0,1
|
>0,05
|
3,0±0,1
|
5,2±0,1
|
<0,001
|
|
СОД, МЕх106 кл/ч
|
0,11±0,01
|
0,09±0,01
|
<0,001
|
0,11±0,01
|
0,07±0,01
|
<0,01
|
|
Каталаза, мккатал х1010 кл
|
5,2±0,1
|
5,1±0,1
|
>0,05
|
10,5±0,1
|
10,0±0,1
|
>0,05
|
|
III (n=12)
|
Глютатион,мгх1010 кл
|
3,5±0,1
|
4,5±0,1
|
<0,001
|
2,7±0,1
|
5,5±0,1
|
<0,001
|
|
СОД, МЕх106 кл/ч
|
0,10±0,02
|
0,07±0,02
|
>0,05
|
0,25±0,02
|
0,19±0,02
|
<0,05
|
|
Каталаза, мккатал х1010 кл
|
5,5±0,1
|
5,9±0,1
|
<0,0 1
|
8,7±0,1
|
11,0±0,1
|
<0,001
|
|
IV (n=11)
|
Глютатион,мгх1010 кл
|
4,1±0,1
|
4,4±0,2
|
>0,05
|
2,5±0,2
|
4,9±0,2
|
<0,001
|
|
СОД, МЕх106 кл/ч
|
0,15±0,01
|
0,18±0,02
|
>0,05
|
0,09±0,02
|
0,14±0,01
|
<0,05
|
|
Каталаза, мккатал х1010 кл
|
5,7±0,1
|
5,3±0,1
|
<0,01
|
9,0±0,1
|
8,2±0,1
|
<0,001
|
Рис. 1. Схематическая структура поверхностных белков мембраны эритроцита
(интактная, после обработки ферроколлиодом, магнетитом - МУС-Б).
Литература:
1. Асатиани В.С. Ферментные методы анализа // М.: Наука, 1969. – 580 с.
2. Госпатент Украины №30538А UA A 23L 1/304 Лечебно-профилактический продукт “ Micromage-B ”. / Белоусов А.Н. (Украина) №98052704 Заявл.25.05.98. Опубл. 15.11.00. Бюл. №6-11.
3. Госпатент №24322А UA A61N2/00. Сорбент для экстракорпоральной детоксикации биологических жидкостей . / Белоусов А.Н. (Украина) № 97062918 Заявл. 19.0 6 .97; Опубл. 17.07.98.
4. Костюк В.А., Потапова А.И., Ковалева Т.В. Вопросы медицинской химии. - Москва. -1990. Т.36. №2. С.89-91.
5. Мельников В.В. Лабораторные методы исследования в клинике. // М.: Медицина, 1987. – 280 с.
6. Belousov A.N. Experimental study of activity of magnet-controlled haemosorbent with respect to blood protein fractions. // Eighth International Conference on magnetic fluids. - Timisoara , Romana. 1998. - P. 478-479.
7. Belousov A.N. New trend in extracorporal detoxication of biological fluids. // Eighth International Conference on magnetic fluids. - Timisoara , Romana. 1998. - P. 484-485.
8 Chasis J.A., Mohandas N. J. Cell Biol., 1986, v.103, 343р.
9. Peter E. Cohan Technology and Value Creation in Combinatorial Materials Science // COMBI 2001 - The 4th Annual International Symposium on Combinatorial Approaches for New Materials Discovery. San Diego , CA USA , 2001. - 231 p.
|
